热门应用技术

常见问题与解决方案

1.样本制备

（1）提取组织或细胞蛋白时，裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，该如何处理？

答：在使用裂解液(G2002-100M)，裂解的产物中出现少量透明胶状物通常是基因组 DNA 等成分形成的复合物，属于常见现象。若不检测与 DNA 紧密结合的蛋白，可直接离心取上清用于后续实验；若需检测结合紧密的蛋白或转录因子，可通过超声处理将胶状物打散后再离心取上清。

Tips：完全裂解液能确保从样本中提取蛋白的量和状态。建议提取过程保持低温环境，我司低温研磨仪（SWE-FP PLUS）可在全程‑50℃下高效研磨动物、植物及骨头等硬组织，保护 RNA 和蛋白不降解；搭配骨专用适配器（SWE-FP-0224F /SWE-FP-0512F）研磨更彻底，同时配备‑20℃独立冻台，可用于样本储存和电泳转膜等低温需求，是实验室高效、安全的组织研磨设备。

（2）磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加磷酸酶抑制剂？

答：在使用磷酸化抗体检测磷酸化蛋白时，样本制备过程中除必须加入蛋白酶抑制剂外，还需要同时加入磷酸酶抑制剂（G2007-1ML），以防止磷酸酶导致蛋白去磷酸化。

Tips: 本产品为升级版广谱型磷酸化蛋白酶抑制剂，在旧版基础上新增多种关键组分，可更高效抑制丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸及酸碱性磷酸酶；同时将原两管试剂优化为单管，使用更便捷。

2.蛋白定量和裂解

（1）为何要使用 BCA法蛋白定量检测试剂盒（G2026-200T）测蛋白浓度？是否一定要做？

答：主要用于测定蛋白浓度，一般建议进行，尤其是在做半定量分析、比较表达趋势时更为必要。

Tips: 该方法不受绝大部分样品中化学物质的影响，可以兼容样品中高浓度的去垢剂。但螯合剂和高浓度还原剂会影响检测结果，若样本中含有螯合剂或还原剂，可考虑本公司其他产品Bradford法蛋白定量检测试剂盒(G2001-250ML)。

（2）WB常规变性上样缓冲液（loading buffer ）还原性与非还原性有何区别，应如何选择，以及不加还原剂会有什么后果？

答：还原性 Loading Buffer含有 β- 巯基乙醇或 DTT，能打开二硫键，使蛋白完全变性呈线性，适合大多数 WB 检测；非还原性 Loading Buffer不含还原剂，蛋白保持部分折叠和亚基结构，适用于检测聚合体或构象表位。如果不加还原剂，蛋白可能无法充分变性，导致条带迁移异常、出现聚集体或信号变弱。

Tips: 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(无气味、还原性)（G2075-10ML）使用了还原性与二硫苏糖醇（DTT）或巯基乙醇（气味较大）相近的物质，且无气味，水溶性更稳定，使用效果与常规的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液无明显差异，因此使得蛋白上样操作更加安全健康。

（3）WB常规变性上样缓冲液（loading buffer ）中有哪些组分，各组分的作用是什么？

① loading buffer 中的甘油可增加样品密度，保证样品顺利沉入加样孔中，避免样品漂浮外溢。
② loading buffer 中的溴酚蓝作为示踪染料，用于直观指示样品在凝胶中的迁移位置，便于判断电泳终止时机。
③ loading buffer 中的 Tris 可将缓冲体系的 pH 稳定在约 6.8，防止低温保存过程中蛋白肽键断裂，维持蛋白稳定性；同时还能抑制部分酶促反应，减少蛋白降解。
④ loading buffer 中的 SDS 可破坏维持蛋白二级、三级结构的氢键，掩盖蛋白本身电荷，使蛋白整体带负电，并与硫醇类还原剂协同作用，使蛋白呈线性状态，从而使电泳分离主要依赖分子量大小。
⑤ loading buffer 中的硫醇类试剂用于还原半胱氨酸之间形成的二硫键，同时其抗氧化特性可防止半胱氨酸被氧化，与 SDS 协同使蛋白充分线性化。

3.制胶和蛋白电泳

（1）如何选择分离胶的浓度？

答：根据目的蛋白的分子量大小，选择合适的分离胶浓度。

Tips:10% PAGE彩色凝胶超快速配制试剂盒（G2043-50T）孔型清晰、制胶便捷且无需 TEMED，更采用无 SDS 配方，可以兼容非变性PAGE凝胶电泳。您也可选择一步法手动梯度PAGE彩色凝胶快速配制试剂盒（G2193-50T），制胶无需再区分浓度，大/中/小分子量蛋白都能有效分离。

（2）使用凝胶试剂盒配置的凝胶不凝或凝得很慢该如何处理？凝胶是否必须现配现用？若可提前配置，应如何保存及保存多久？

答：凝胶通常与温度、光照或促凝剂用量有关，可适当增加促凝剂用量。凝胶建议现配现用以保证最佳质量和重复性。

（3）如何选择Marker?

答：选择 Marker 时，要根据目标蛋白的分子量，尽量让它落在 Marker 量程的中间位置；同时结合胶浓度，小分子蛋白用低范围 Marker，大分子蛋白用宽范围 Marker。

Tips:Prestained Protein Marker X(G2091-250UL)指示蛋白分子量范围为：10-180kDa，包含蓝色，玫红色，紫色三种颜色条带，辨识度更高，更方便观察，适合作为SDS-PAGE和Western blot的蛋白质分子量标准。搭配垂直电泳仪（BVE-4）和1×SWE快速高分辨电泳缓冲液（G2149-1L），WB结果更好。

（4）针对不同的蛋白，电泳时的电压和电流如何选择？如何判断电泳终止时间？

答：一般采用 80 V 跑浓缩胶、120 V 跑分离胶，并无严格区分。当溴酚蓝迁移至凝胶底部附近时即可停止电泳。

Tips:推荐使用电泳电源（SPW-M500），其最大电流可达 1750mA，配合专用转膜液（G2173-1L）可实现 5-15 分钟超快湿转，条带均一效果好；配备两组独立输出，可同时进行电泳和转膜；支持梯度电压 / 电流定时切换，断电记忆功能确保实验不中断；高清触摸屏实时显示参数，具备过压、过流、漏电等多重保护，安全可靠，是实验室高效蛋白分析的理想选择。

（5）怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？

答：影响跑胶质量的主要因素包括：

① 电压：较低电压可充分发挥凝胶分子筛效应，电压越低，条带越整齐。一般浓缩胶 80 V、分离胶 100 V 即可获得良好效果。

② 凝胶均匀度：凝胶越均匀，条带越窄、分离越清晰。倒胶前应充分混匀，玻璃板保持清洁，加水隔离时动作要轻，避免稀释分离胶上层。

Tips:推荐使用制胶仪（T-20 PLUS）。产品小巧便携、安装快捷，能实时混匀试剂，适配多种玻璃板，可轻松配制 4%-20% 的梯度胶和等度胶；搭配大通量制胶器可快速批量连续制胶，配合试剂盒单块胶成本不到 1 元，性价比高，适合实验室快速批量制胶。如需更简便的选择，可使用 10% Tris SwePAGE 预制胶（G2316-10），即开即用，无需配胶，避免接触有毒试剂；胶板经特殊处理，搭配 SWE 高分辨快速电泳缓冲液（G2149-1L）条带更锐利清晰，不含 SDS 也可用于非变性电泳，兼容大多数小型垂直电泳槽，适合快速、高质量的蛋白分离。

4.转膜

（1）针对不同的蛋白，转膜的电压和电流如何选择？如何选择膜的材质与孔径？

答：我们的转膜条件是150mA恒流，针对1mm厚的胶；膜的选择上，20 kDa 以下蛋白推荐 0.22 μm 孔径，20 kDa 以上蛋白推荐 0.45 μm 孔径，材质可根据需求选用 NC 膜（G6014-15*15CM）或 PVDF 膜（G6045-0.22）。

Tips: NC膜是亲水膜，无需使用甲醇、乙醇溶液等活化；PVDF膜为疏水性，膜孔径有大有小，膜孔径越小对分子量低的蛋白结合越牢固。根据膜孔径大小，一般有0.1 μm、0.2 μm、0.45 μm及1.0 μm等不同规格。

（2）针对分子量很小和很大的蛋白，电泳和转膜这两个步骤有什么建议？

答：大分子量蛋白建议使用 Tris-Acetate 凝胶，小分子量蛋白建议使用Tricine 凝胶；转膜时主要通过调整转膜时间控制，分子量越大，转膜时间越长。

（3）不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？

答：转移缓冲液中加入终浓度 10% 甲醇以增强蛋白与膜的结合；加入终浓度 0.1% SDS 提高转移效率；选用高质量转移膜，使用低浓度凝胶（如 6%），并适当提高电流或延长转膜时间。

（4）蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至 66KD，大至 170KD，可以一次做好吗？

答：跨度过大不利于转移。一般建议分开处理，例如 21 kDa 与 66 kDa 可用 10% SDS-PAGE，湿转 150 mA 50–60 min；150 kDa 蛋白可用 8% SDS-PAGE，150 mA 90 min，并根据实验结果调整。

5.封闭

（1）封闭液该如何选择？

答：常用封闭液包括脱脂奶粉（GC310001-500g）与BSA（GC305006-100g）以及无蛋白封闭液（G2052-500ML）。脱脂奶粉价格低，但成分复杂，适用范围较窄；BSA成分单一，适用范围广，封闭效果好但价格较高；无蛋白封闭液不含动物蛋白，适合磷酸化蛋白检测，背景低、特异性好；

Tips: GC305006-100g为进口生物技术级牛血清白蛋白，成分单一，可满足大部分常规生物学实验需求。G2052-500ML为新一代无蛋白快速封闭液，可快速填充固相支持物表面的空隙，减少非特异性信号的干扰；整体封闭效果明显优于传统的基于BSA（牛血清白蛋白）、脱脂奶粉、酪蛋白（Casein）等的封闭液；可用于Western Blot（WB）、IHC和IF等实验中的封闭、一抗稀释。

（2）Tween-20 在封闭液中起什么作用？

答：Tween-20（GC204002-100ml）是一种去污剂，通常以 0.05% - 0.1% 的浓度加入封闭液（及抗体稀释液）中。它可以阻断非特异性疏水相互作用，减少背景噪音，同时有助于抗体与抗原的结合。

Tips:推荐无蛋白快速封闭液（G2052-500ML）只需 5 分钟即可完成 WB 封闭，背景更低、信噪比更高；不含蛋白、生物素及影响酶活性的防腐剂，与 HRP、AP 和生物素检测体系完全兼容；还可直接用于一抗稀释，使用方便、实验更稳定。         

6.内参相关问题

（1）WB实验中，如何选择内参？

①样本种属来源：首先考虑实验样本来源于何物种。

②目的蛋白分子量：选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差 5 kDa 以上但勿差距太大。

③目的蛋白表达部位：针对一般蛋白质检测，GAPDH、β-actin 或β-tubulin 可以满足要求，如果需要检测亚细胞器蛋白时，适选择对应亚细胞器内参更能体现内部参照的准确性。比如常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、TBP、YY1、Histone H3。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为ATP1A1。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

④实验环境的影响：以上原则仅针对通常情况，需要注意的是内参的选择须考虑实际实验环境状况，比如某些细胞或组织由于缺氧、糖尿病等因素导致 GAPDH 的表达量增高，此种状况下 GAPDH 不适合做内参；在涉及细胞增殖相关实验中，c-Jun 由于自身表达变化就不适合做内参；在凋亡实验中，TBP、Lamin B 等不适合作为核内参。因此在设计实验方案时应考虑这些因素的影响并查询相关文献。

7.其它常见问题

（1）检测出的分子量与理论分子量有差异是什么原因造成的，怎么解决？

①蛋白发生翻译后修饰（如磷酸化、糖基化等），会导致分子量增大。
②蛋白在变性后发生复性，形成二聚体、三聚体或四聚体，表现出的分子量可能为单体的 2 倍、3 倍或 4 倍。
③蛋白在活化过程中被剪切，例如以前体形式合成后再加工为活性片段，导致实际分子量变小。
④蛋白的表观分子量与理论计算值存在差异，如 p53 蛋白表观分子量约为 53 kDa，而按氨基酸序列计算约为 43 kDa。
⑤同一蛋白可能存在多个亚型，不同亚型分子量不同。
⑥凝胶变形或 Marker 迁移异常，导致分子量判断出现偏差。
⑦蛋白发生降解，产生较小分子量条带。

（2）Western blot结果中杂带较多，是什么原因造成的，怎么解决？

①目标蛋白存在多个修饰位点（如磷酸化、糖基化、乙酰化等），本身可呈现多条带。

②目标蛋白存在不同剪切体：查阅文献或进行生物信息学分析验证可能性。
③样本处理过程中目标蛋白发生降解：加入蛋白酶抑制剂，并在低温条件下操作。
④上样量过大，检测过于敏感：适当减少上样量。
⑤一抗或二抗浓度过高：降低抗体使用浓度。

Tips: WB 蛋白拖尾优化试剂（G2192-10ML）可有效改善 WB 条带拖尾，尤其适合组织样本，使实验结果更准确、重复性更好；只需将蛋白样品按 1:1 比例与试剂混合，静置 10 分钟后补加 loading buffer 即可进行常规 WB 操作，拖尾严重时可适当提高比例，使用简单方便。

（3）Western blot结果中背景较高，是什么原因造成的，怎么解决？

① 膜封闭不足：可延长封闭时间或更换更合适的封闭液。

② 一抗稀释比例不合适：对抗体进行梯度稀释测试，选择合适的稀释度，适当降低抗体浓度。

③ 一抗孵育温度过高：建议在 4℃ 条件下孵育过夜。

④ 曝光时间过长：适当缩短曝光时间。

⑤ 洗膜不充分：延长洗膜时间或增加洗膜次数。

（4）Western blot结果中无信号或显示信号弱，是什么原因造成的，怎么解决？

① 检测样本不表达目标蛋白

答：选用高表达该蛋白的细胞作为阳性对照，以确认样本是否为阴性。

② 检测样本中目标蛋白表达量较低

答：增加上样量，裂解液中加入蛋白酶抑制剂，对样本进行浓缩；检测核蛋白应使用核裂解物，检测膜蛋白应使用膜蛋白裂解液；必要时通过药物或其他方式诱导目标蛋白表达。

③ 目标蛋白为分泌型蛋白，已分泌至细胞外

答：可使用 Brefeldin A（BFA）抑制蛋白分泌，再提取全细胞裂解液进行检测。

④ 全细胞裂解液中检测不到目标蛋白

答：可尝试提取细胞培养上清中的蛋白进行检测。

⑤ 裂解不充分导致信号弱或无信号

答：可结合以下方法改进。

⑥ 超声处理不足

答：建议在加入裂解液后对样本进行超声破碎，尤其是核蛋白样本。

⑦ 转膜不完全或过度转膜

答：可用丽春红染膜并结合考马斯亮蓝染胶判断转膜情况，并适当调整转膜时间和电流；PVDF 膜使用前需用甲醇活化。

⑧ 转膜操作不当

答：注意不同分子量蛋白选择合适的膜孔径、转膜条件和试剂。

⑨ 抗体不能识别检测样本所属种属的蛋白

答：购买前仔细阅读抗体说明书，确认其种属交叉反应性。

⑩ 一抗或二抗结合量不足

答：适当提高抗体浓度，并在 4℃ 条件下延长孵育时间（如过夜）。

⑪ 二抗与一抗不匹配

答：选择针对一抗来源种属的二抗。

⑫ 叠氮钠抑制 HRP 活性

答：避免在 HRP 标记二抗体系中使用含叠氮钠的溶液。

⑬ 洗膜过度

答：避免过度洗膜，防止信号被洗掉。

⑭ 检测试剂或底物失效

答：更换新鲜的底物或试剂盒。

Tips: 若经常遇到弱膜信号出不来、强膜容易过曝、条带深浅不一等问题，可考虑使用多功能荧光成像系统（SCG-W6000）：

弱信号更易检出：支持累积曝光模式，一次成像即可获得清晰结果。

强信号不过曝：0.1 s 精细调节曝光，避免高表达条带 “爆掉”。

Marker 更干净：即使 Marker 存在非特异性结合，也可一键还原真实条带。

同膜多标：在同一张膜上同时检测 3 种蛋白，减少膜间差异与操作误差。

常规预染 Marker 也能用于荧光 WB：独创反色功能，降低实验成本与门槛。

结果可回溯、可优化：配套 “源文件分析软件” 可调整时间轴，任意选择不同深浅条带的信号进行分析。

凝胶成像：支持彩色蛋白胶成像，条带层次清晰、颜色真实，让实验结果更易观察与判断。

（5）WB 条带出现歪斜或漂移的原因及解决方法是什么？

答：在排除电泳阶段条带已歪斜的前提下，可能原因包括：

① 转膜“三明治”结构中海绵垫因长期使用变薄或夹持不紧，导致胶与膜之间存在间隙，使蛋白在转移过程中偏移，或膜、凝胶发生倾斜。

② 转移液未完全浸没凝胶和膜，影响电流均匀通过。

（6）Western Blot 中抗体的可以重复应用吗？

答：若抗体稀释液中含有保护剂，可在 4℃ 条件下重复使用至少 3 次，使用过程中应避免反复冻融。

常见问题与解决方案

1.抗体基础知识

（1）什么是抗体，简述其大致结构？

答：抗体是机体在抗原刺激后，由B细胞分化形成的浆细胞所分泌的一类免疫球蛋白，能够与相应抗原发生特异性结合反应。其基本结构呈“Y”字形，由两条分子量较大的重链（H链）和两条分子量较小的轻链（L链）通过二硫键及非共价键相互连接而成。抗体分子中，靠近N端、氨基酸序列变化较大的区域称为可变区，是与抗原结合的主要部位；而靠近C端氨基酸序列相对稳定的区域称为恒定区。

2.一抗和二抗选择、使用和保存

（1）怎么给客户挑选合适的一抗？

答：首先需要与客户确认靶点名称、样本种属和实验类型这三项基本信息。在这些前提条件明确且满足的情况下，再结合客户对单抗或多抗的偏好以及具体实验需求，并参考官网提供的检测图片和相关文献数量，综合判断后灵活推荐最合适的产品货号。

（2）在选择一抗的种属来源时需要注意什么？

答：一抗的宿主种属应尽量与样本种属不同，以避免配套二抗与样本中内源性免疫球蛋白发生交叉反应，从而引起非特异性染色。例如，当样本来源为兔时，应尽量避免选择兔源的一抗（无论是多抗还是单抗）。但对于WB实验中的细胞裂解液样本，由于其中通常不含内源性免疫球蛋白，因此对一抗来源种属的要求可以相对放宽。

（3）二抗如何选择？

① 一抗的物种来源：二抗应针对一抗的来源种属进行选择。例如，一抗来自小鼠，则二抗应选择抗小鼠的抗体。

② 一抗的类别和亚类：二抗需要与一抗的免疫球蛋白类别或亚类相匹配。例如，多克隆抗体通常属于IgG类，则二抗应选择抗IgG抗体；若一抗为小鼠来源的IgM型单克隆抗体，则二抗应选择抗小鼠IgM（或明确覆盖该亚类的抗体）。

③ 实验类型：不同实验对二抗的形式要求不同。例如，ELISA和WB实验通常使用酶标二抗，而流式细胞术或免疫荧光实验则需选择与荧光染料或荧光蛋白偶联的二抗。

（4）单克隆抗体和多克隆抗体有什么区别？该怎么选？

答：多克隆抗体灵敏度较高，能够识别免疫原上的多个表位，更容易检测到与免疫原高度同源的蛋白，且价格相对较低，但发生非特异性染色的可能性较大。单克隆抗体仅识别单一表位，特异性强、背景低，但其识别位点受限，灵敏度可能相对较低。因此，当使用单抗效果不理想时，可尝试更换为多抗，往往能获得较好的检测结果。单抗和多抗各有优缺点，应根据具体实验需求进行选择。

（5）重组抗体相比传统抗体，优势在哪里？

答：相比传统抗体，重组抗体通过基因工程在体外表达，不依赖动物免疫，因此批次间高度一致、稳定性更高，有效避免了传统抗体批间差异大、易受动物个体影响的问题，并且能精准识别多种物种与修饰位点，特异性更佳。凭借我们科普欣公司严格的质控验证，其在 WB、IHC、IF 等多种实验上均表现出卓越的性能，是科研实验中更可靠、更经济的选择。

（6）同一目标蛋白的抗体，为什么适用的实验类型（WB/IHC/IF）不一样？

答：这是因为不同实验对蛋白结构的处理方式不同。WB实验中蛋白会被变性处理，抗体主要识别线性表位；而 IHC 和 IF 实验通常在变性较弱的条件下进行，蛋白保留了更多空间构象，抗体识别构象表位。抗体通常是在特定条件下筛选出来的，因此其识别能力会受到实验条件的限制，导致适用范围不同。

（7）标签抗体（Flag/HA/His）该怎么选？适用哪些实验场景？

答：标签抗体的选择主要取决于实验目的。His标签主要用于蛋白纯化，WB 检测时易受缓冲液影响；Flag和HA标签分子量小、对蛋白结构影响小，特异性高，更适合WB、IP、IF和CoIP等检测实验。如果需要做细胞定位或免疫共沉淀，优先选择Flag或HA标签抗体。

（8）一抗的最佳稀释比例如何确定，应如何保存，以及过期后是否还能使用？

答：最佳稀释比例通常参考说明书并通过梯度预实验确定；一抗收到后应分装保存于 - 20℃，避免反复冻融，工作液可短期 4℃保存；过期后的一抗效果可能下降，建议先通过预实验验证活性，若结果正常可继续使用。